MTT assay 是一種以比色法原理進行的細胞活性 (cell viability) 與細胞毒性 (cytotoxicity) 分析方法，具有價格低廉、操作簡單的優勢，是目前最廣泛使用的細胞增生 (cell proliferation) 和藥物毒性篩選方式之一。本篇文章將針對 MTT assay 初學者經常遇到的 8 個實驗細節問題，從操作流程、對照組設計到讀值分析，一一解答，協助你更快上手，有效進階。
- 怎麼知道細胞是在對數生長期？會影響實驗結果嗎？
- 使用不同孔盤（如 24-well vs 96-well）數據可比嗎？
- 若紫色反應過弱或不清楚，可以如何改善？
- MTT assay 一定要建立標準曲線嗎？
- 如何根據實驗目的（細胞生長 vs 藥物毒性）設計對照組？
- 空白組設計和參考波長有什麼差別？每次實驗都需要嗎？
- 怎麼將吸光度數據繪製成 Cell Viability 與 IC50 圖表？
- 沒有 ELISA reader，改用分光光度計測 MTT assay，結果可靠嗎？
💡 MTT assay 偵測原理快讀
MTT assay 偵測原理是利用細胞內的酵素（主要為粒線體脫氫酶 succinate dehydrogenase）能夠將黃色 MTT 試劑還原為紫色 formazan 結晶的特性，透過測量產物形成的顏色深淺變化（常以吸光度 OD570 表示），即可評估藥物、基因操作或培養條件對細胞存活率與代謝活性的影響。
Q1.怎麼知道細胞是在對數生長期？會影響實驗結果嗎？
答：MTT assay 最理想的操作時機，就是在細胞處於「對數生長期 (log phase)」的階段。這個階段的細胞活性與代謝最旺盛，MTT 被還原為 formazan 的效率也最高，更能準確反映細胞數量與生長變化。那要如何判斷細胞是否處於對數生長期呢？以下整理出幾個常用方法。
判斷細胞是否處於對數生長期的常用方法
| 判斷方式 | 說明 | 優點 | 注意事項 |
|---|---|---|---|
| 觀察細胞型態 | 貼附型細胞在對數期通常貼附良好、排列均勻、形態規則（如扁平、梭狀）；懸浮型細胞則形態圓潤、大小一致、分布均勻，且少有聚集現象 | 快速簡單，適合日常觀察 | 初期建議由熟悉細胞型態的研究人員協助判讀 |
| 估算細胞密度或覆蓋率 (confluency) | 懸浮細胞於 2–8 × 10⁵ cells/mL、貼附細胞達 40–80% 覆蓋率時，通常處於對數期 | 操作簡單，僅需顯微鏡或細胞計數儀 | 不同細胞株生長特性不同，建議參考產品手冊或文獻資料調整 |
| 推算接種時間與 doubling time | 根據該細胞株的 doubling time 推估，接種後 24–48 小時通常處於對數期 | 可事先規劃，提升實驗效率 | 須確認 doubling time 參考資料來源的正確性 |
| 建立細胞生長曲線 | 連續 3–5 天定期取樣，計數細胞數或測量 OD，繪製 growth curve 判斷生長階段 | 最準確，可明確區分 lag、log、plateau 等時期 | 耗時繁瑣 |
| 小規模預試驗 | 僅觀察 1–2 天在不同接種密度或時間點的細胞數或吸光度變化，找出吸光度快速上升時段作為最佳操作期 | 可快速評估細胞是否進入對數期，不需繪製完整生長曲線 | 僅供初步推斷，建議搭配其他方法交叉驗證 |
如果不在對數生長期進行 MTT assay，可能會對結果造成什麼影響？
| 細胞所處階段 | 特徵描述 | 對 MTT assay 結果的影響 |
|---|---|---|
| 貼附不良期 / 適應期 (Lag phase) | 常見於剛解凍或接種後不久細胞，此時細胞尚未穩定增殖，數量偏少，代謝活性低 | 吸光度偏低，可能低估細胞活性或誤判藥物毒性 |
| 平台期 / 飽和期 (Plateau phase) | 常見於培養時間過久的細胞，此時已達密度上限，細胞生長停滯、代謝降低，可能發生凋亡、貼附性下降、廢物堆積導致培養環境酸化等現象 | 吸光度降低或讀值波動，造成實驗結果再現性差，難以正確判讀藥效或毒性影響 |
Q2.使用不同孔盤（如 24-well vs 96-well）數據可比嗎？
答：雖然一樣是進行 MTT assay，但在實際操作上，24-well 和 96-well 孔盤在細胞用量、培養體積、光徑長度與偵測條件等方面都有明顯差異，因此無法將兩者的吸光度（OD 值）直接換算或比較。
使用不同孔盤進行 MTT assay 的差異性
| 24‑well plate | 96‑well plate | |
|---|---|---|
| 每孔培養液體積 (µL / well) | 500 – 1000 | 100 – 200 |
| 每孔貼附型細胞數量 (cells / well) | 2.5 – 5 × 10⁴ | 0.5 – 1 × 10⁴ |
| 每孔懸浮型細胞濃度 (cells / mL) | 2 – 8 × 10⁵ | 1 – 5 × 10⁵ |
| MTT 試劑用量¹ (µL / well) | 50 – 100 | 10 – 20 |
| 溶解液用量² (µL / well) | 500 – 1000 | 100 – 200 |
| 光徑長度³ (cm) | ≈ 1.0 | ≈ 0.5 |
2. 溶解液（如 DMSO）用量通常與培養液體積等量
3. 根據比爾-朗伯定律 (Beer-Lambert Law)，光徑越長，吸光度（OD 值）越高
如果想比較 24-well 與 96-well 的實驗結果，可以怎麼做呢？
建議先將 OD 值轉換為相對存活率（例如設定對照組為 100%），再觀察各處理組之間的變化趨勢。這樣就能排除孔徑、光徑與培養體積不同所造成的影響。換句話說，雖然無法直接比對不同孔盤的原始 OD 值，但只要實驗設計合理、操作得當，彼此之間仍具有良好的參考價值。
Q3.若紫色反應過弱或不清楚，可以如何改善？
| 問題情境 | 可能原因 | 改善建議 |
|---|---|---|
| 紫色反應顯色不明顯、反應過弱 | 1. 細胞數太少或未處於對數生長期 2. MTT 反應時間太短 3. 細胞代謝活性低或藥物影響代謝 | ✅ 拉長細胞培養時間或提高接種密度，確保細胞進入對數期後再進行反應 ✅ 依產品說明書建議或細胞代謝速度調整拉長 MTT incubation 時間（常見為 3–4 小時，最多不超過 6 小時，避免產生非特異性背景干擾） |
| 背景顏色偏紅，影響判讀 | 培養基中含有酚紅 (phenol red) 或高濃度血清 | ✅ 在加入 MTT 試劑前更換為無酚紅、低血清或無血清的培養液，以避免干擾比色判讀 |
| Formazan 結晶未完全溶解 | 1. 溶解液種類或用量不當 2. 未充分混勻 3. 溶解時間不夠或溫度太低 | ✅ 依產品說明書指示選用溶解液，常見的有 DMSO、Acidic isopropanol（如 isopropanol + 0.04 N HCl）、以及含 SDS 的溶液（如 10% SDS in isopropanol） ✅ 建議溶解液體積與培養液等量（1:1），如培養液為 100 μL，即加入 100 μL 溶解液；若產品建議或顯色偏弱時，可適度增加至 1.2 倍 ✅ 加入溶解液後，立即使用 pipette 上下抽吸混勻 (up-and-down)，或使用 plate shaker 混合¹。混勻時應避免液體飛濺或產生氣泡，以免干擾讀值 ✅ 將培養盤置於 37°C 孵育 10–30 分鐘促進溶解，必要時可延長至 1 小時 |
| 顏色明顯但 OD 值仍偏低 | 1. 使用錯誤的偵測波長 2. 未設定參考波長 3. 不適宜的微量盤狀態（如盤底不平、盤蓋未取下） | ✅ 確認偵測波長設定正確（通常為 570 nm，或依產品說明書指示） ✅ 若設備許可，建議同時偵測參考波長（常見為 630 nm 或 690 nm），以扣除盤底刮痕、氣泡或塑膠材質干擾等背景雜訊，提高準確性與靈敏度 ✅ 確認微量盤狀態良好，避免盤底歪斜、殘留指紋、氣泡或未移除盤蓋造成誤差 |
Q4.MTT assay 一定要建立標準曲線嗎？
答：不一定，取決於你的實驗目的。簡單說明如下：
- 比較不同處理條件對細胞存活率的影響（例如藥物處理組 vs 對照組）：這是 MTT assay 最常見的使用情境，通常不需要建立標準曲線。只要將吸光度（OD 值）轉換為相對存活率（例如設定對照組 = 100%），即可比較不同組別間的變化趨勢。
- 建立細胞生長曲線或估算細胞數量：這種情況則需要建立細胞數與吸光度的標準曲線，以便利用 OD 值推算細胞數或濃度。要注意的是，標準曲線僅適用於相同細胞株、相同培養與反應條件下，且 OD 值應落在線性範圍內（通常為 0.1–1.0），否則可能導致結果推算不準。
💡 雖然標準曲線可以作為「絕對定量」的參考，但細胞狀態、代謝速率和培養條件的微小變化，都有可能讓標準曲線產生偏移。因此若不是以定量細胞數為目的，多數研究人員仍偏好使用「相對比較法」來評估細胞反應趨勢，因為操作更簡單、直覺，且再現性佳。