Q&A｜MTT assay 新手最容易卡關的8個實驗細節與快速進階秘訣（下）

Q5.如何根據實驗目的（細胞生長 vs 藥物毒性）設計對照組？

答：對照組是用來提供「比較基準」的重要依據，以下是不同應用情景下，常見的 MTT assay 對照組設計。

評估藥物或處理條件對細胞毒性的影響（例如藥物處理組 vs 對照組）

實驗對照組名稱	細胞	藥物溶劑	藥物
空白組 (Blank control) 不加細胞與藥物，用來排除培養液與反應試劑本身對吸光度的背景干擾	✘	✘	✘
未處理對照組 (Untreated control) 作為細胞存活的基準組，通常設為 100%，用來換算其他組別的相對存活率	✔	✘	✘
溶劑對照組 (Vehicle control) 用來確認藥物溶劑本身對細胞是否具有毒性，可作為藥物實驗的背景參考	✔	✔	✘
處理組 (Treatment group) 用來測試不同濃度藥物對細胞的影響	✔	✔	✔
陽性對照組 (Positive control) 用來驗證系統是否能正確反映毒性反應，常使用已知具細胞毒性的藥物（例如 staurosporine）	✔	✔¹	✔

1. 若陽性藥物為水溶性，將會直接使用細胞培養液稀釋，不會再額外添加使用藥物溶劑。

觀察細胞生長趨勢（如繪製生長曲線）

這類實驗主要是觀察細胞在不同時間點的增殖情形，通常不需要像細胞毒性分析那樣設置多種處理組。不過仍建議設置基本的「空白組」（即不加細胞，僅含培養液、MTT 試劑與溶解液），以扣除試劑與培養基本身的背景吸光值，確保吸光度測量的準確性與再現性。

Q6.空白組設計和參考波長有什麼差別？每次實驗都需要嗎？

答：空白組 (Blank control) 和參考波長 (Reference Wavelength) 都是為了排除背景干擾，但一個是用來「扣除試劑本身造成的背景吸光」，另一個則是用來「修正微量盤造成的光學雜訊」。兩者可以同時使用，讓數據更準確穩定。以下表格幫你快速搞懂它們在 MTT assay 實驗中的作用和設計差異。

	空白組	參考波長
作用目的	扣除培養液、MTT 試劑和溶解液本身的背景吸光值	修正盤底材質、氣泡、刮痕等造成的光學誤差
設計方式	不加細胞，只加培養基、MTT 試劑和溶解液（如 DMSO）	選擇紫色 formazan 產物幾乎不吸收、且遠離其主吸收峰的波長作為修正雜訊依據
是否每次實驗都需要	是	建議^¹

1. 若儀器設備支援，建議同時偵測主波長（如 OD570）與參考波長（通常為 OD630 或 OD690），以自動進行背景修正。實際參考波長設定請依照 MTT 試劑說明書指示。

Q7.怎麼將吸光度數據繪製成 Cell Viability 與 IC₅₀ 圖表？

答：在完成 MTT assay 後，如何把 OD 吸光值（例如 OD570）轉換為清楚的「相對細胞存活率（Cell Viability %）」圖表，並進一步估算 IC₅₀，是許多研究人員關心的重點。以下提供實用範本和最常見的步驟做法：

步驟一﹑計算相對細胞存活率 (Cell Viability %)

以「未處理對照組（Untreated control）」作為 100% 存活基準，「空白組（Blank）」作為背景校正，套用以下公式：Cell Viability (%) = (Sample OD − Blank OD) / (Untreated control OD − Blank OD) × 100
Sample OD：樣品組的平均吸光值
Untreated control OD：未處理組（如 0 µM 藥物）的平均吸光值
Blank OD：空白孔（不含細胞）吸光值，用來扣除培養液與試劑本身的背景吸光值
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這份範本支援 6 重複實驗，使用時僅需更新濃度數據、輸入不同濃度組別的 OD570 數值，表格即會自動計算：OD 平均值、Cell Viability (%)、標準差 (SD)、相對標準差 (%RSD) 與標準誤 (SEM)。

步驟二﹑繪製劑量反應曲線

以藥物對數濃度為 X 軸（log₁₀[濃度]）、Cell Viability (%) 為 Y 軸進行繪製。常用繪圖工具有：Excel、GraphPad Prism、SigmaPlot 及 Origin。

步驟三﹑計算 IC₅₀（半數抑制濃度）

在 Excel 中，可目視觀察 Viability 下降到約 50% 的濃度區間。若需準確計算 IC₅₀，建議使用 GraphPad Prism。

有關如何使用 GraphPad Prism 繪製劑量反應曲線與精確計算 IC₅₀ 數值，可參考這支簡明清晰的 YouTube 教學影片：🔗 https://www.youtube.com/watch?v=DPmHWUIDkDo。

Q8.沒有 ELISA reader，改用分光光度計測 MTT assay，結果可靠嗎？

答：MTT assay 的關鍵在於準確測量反應產物 formazan 的吸光度（OD 值）。如果手邊沒有 ELISA reader，改用分光光度計 (spectrophotometer) 搭配比色皿 (cuvette) 來測量，一樣可以獲得可靠的數據。以下提供三個小提示：

使用適當溶液補足體積：要把 96 孔盤各 well 的反應液轉移到比色皿中偵測，建議使用原本的溶解液（如 DMSO）、PBS 或不含酚紅的培養液，將體積補足至 1 mL（以 10 mm 標準比色皿為例），讓測量結果更穩定、準確。
正確設定讀取波長：依照 MTT 試劑說明書指示設定偵測波長（常見為 570 nm）。
合理解讀 ELISA reader 與分光光度計測量結果：有時研究人員會想把 ELISA reader 和分光光度計的讀值互相比較，不過兩者在光徑長度、偵測靈敏度、孔徑尺寸等條件上都有所不同，因此彼此間的 OD 值結果是無法直接換算或比較的。但只要將 OD 值轉換為「相對存活率」（例如以未處理組為 100%，其他組依此換算成百分比），就能排除光路設計等設備差異，專注比較藥物或不同處理條件對細胞的影響性。

分光光度計, 吸收光, 微量盤分析儀, 細胞分析試驗