主要差別在於它們的光路設計和測量方式。這兩種設計對測量精度、穩定性和應用各有所不同，具體如下：
單光束分光光度計
- 光路設計：只有 1 條光路，光源發出的光經過樣品後直接進入光檢測器。
- 測量方式：在測量過程中，儀器會測量溶液對特定波長光的吸收度，然後通過內部計算將其轉換為濃度。這通常是透過測量某一特定波長的光強度，並根據朗伯-比爾定律計算吸光度。
- 校準與穩定性：需要頻繁校準，受光源與檢測器漂移影響。
- 精度：精度較低。
- 適用範圍：一般用於簡單測量或短時間測量。
- 價格與複雜性：較便宜，結構簡單。
☀ 優點：(1) 結構簡單，價格通常較便宜；(2) 適合進行單一波長或簡單的測量工作。
☁ 缺點：(1) 需要定期對儀器進行校準，因為樣品或光源的波動會影響測量準確度；(2) 可能需要在每次測量前進行背景光的補償，以避免因光源或檢測器漂移造成的誤差。
雙光束分光光度計
- 光路設計：有 2 條光路，分別通過樣品和參比（通常是空白樣品或溶劑），這兩條光路的光被同時測量並比較。
- 測量方式：儀器同時測量通過樣品和參比的光強度，然後計算出樣品的吸光度。這種設計有助於自動補償光源強度和檢測器漂移，從而提高測量的準確性和穩定性。
- 校準與穩定性：自動補償漂移，穩定性高。
- 精度：精度較高，尤其在長時間測量時。
- 適用範圍：用於需要高精度、長時間或高重複性的測量。
- 價格與複雜性：較貴，結構複雜。
☀ 優點：(1) 測量過程中能自動補償光源和檢測器的漂移，因此不需要頻繁的背景校正，測量穩定性較高；(2) 精度較高，適用於長時間的測量或對誤差要求較高的分析；(3) 可進行快速的重複測量，對於變化不大的樣品測量尤其有效。
☁ 缺點：(1) 結構較複雜，價格較高；(2) 需要較為精確的光路設計和校準，因此儀器的維護要求較高。
比較表
| 特點 | 單光束分光光度計 | 雙光束分光光度計 |
|---|---|---|
| 光路數量 | 1 條光路 | 2 條光路（樣品與參比） |
| 校準與穩定性 | 需要頻繁校準，受光源與檢測器漂移影響 | 自動補償漂移，穩定性高 |
| 精度 | 精度較低 | 精度較高，尤其在長時間測量時 |
| 適用範圍 | 一般用於簡單測量或短時間測量 | 用於需要高精度、長時間或高重複性的測量 |
| 價格與複雜性 | 較便宜，結構簡單 | 較貴，結構複雜 |